Zmieniona ekspresja produktu genu reaktywiaka siatkówki w ludzkich mięsakach ad

Formy utrwalone formalnie w każdej z próbek barwiono hematoksyliną-eozyną i badano mikroskopowo, aby potwierdzić obecność komórek nowotworowych. Monoklonalne przeciwciała i procedury immunohistochemiczne
Guzy analizowano przeciwciałem monoklonalnym Rb-PMG3-245 (podklasa IgG1), które wytworzono przez immunizację myszy białkiem fuzyjnym TrpE / Rb (PATH-0,7); wykazano, że to przeciwciało rozpoznaje produkt genu Rb o 110 kd, po immunoprecypitacji, analizie Western i analizie immunohistochemicznej. 26, 27 Niespecyficzne mysie przeciwciało monoklonalne IgG1 zastosowano we wszystkich doświadczeniach jako kontrolę ujemną.
Analizę immunohistochemiczną przeprowadzono z przeciwciałem Rb-PMG3-245 i niespecyficznym przeciwciałem kontrolnym na zamrożonych skrawkach o 6. Um utrwalonych w formalinie tych samych guzów (końcowe stężenie, 20. G na mililitr). Jako metodę z wyboru wykorzystano technikę immunoperoksydazy kompleksu avidin-biotyna28. Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe antimouse koni (Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubowano przez 30 minut w stężeniu 1: 100. Diaminobenzydynę zastosowano jako ostateczny chromogen, a błękit metylenowy jako barwnik jądrowy.
Analiza obrazu
Rysunek 1. Ryc. 1. Wyniki analizy immunohistochemicznej i obrazowej sutków człowieka wysokiego stopnia. Panel A pokazuje dwa złośliwe włókniste histiaki o podobnej charakterystyce histologicznej. Jeden nowotwór nie ma ekspresji Rb (lewy panel), a drugi ma homogenną ekspresję Rb (prawy panel). Strzałki wskazują na normalne komórki śródbłonka. Panel B pokazuje dwa liposarcomy o podobnych wzorach.
Na histogramach linia pionowa przedstawia próg poziomu pozytywności przeciwciała; obszar strzyknięty po lewej stronie tej linii reprezentuje liczbę jąder, które nie barwią się, a obszar stały po prawej stronie przedstawia jądra, które barwią. Linia przerywana oznacza kilka rozproszonych komórek pozytywnych o wyraźnej intensywności barwienia immunologicznego. Obszar jądrowy oznacza zeskanowany obszar całkowity, a plama dodatnia oznacza odsetek jąder, które uległy barwieniu.
Figura 2. Figura 2. Różnice w ekspresji produktu z genem Rb w czterech mięsakach gładkokomórkowych wysokiego stopnia. Kolejne zamrożone skrawki zastosowano do oceny immunohistochemicznej i analizy Western blotting. Dwa z przebadanych nowotworów (ścieżki i 2) nie wykazały wykrywalnego białka Rb zarówno na bibule i barwieniu immunologicznym; dwa inne (ścieżki 3 i 4) wykazały białko Rb o masie 110 kd podczas blottingu, jak również silne barwienie immunoperoksydazą. Wzory barwienia zostały potwierdzone histogramami uzyskanymi z analizy obrazu, pokazanymi na dole figury. (Zobacz legendę na rysunku 1, aby uzyskać wyjaśnienie histogramów.)
Ilościowe badania immunohistochemiczne za pomocą komputerowego analizatora obrazu (CAS-200, Celi Analysis Systems, Elmhurst, IL) zastosowano do oceny poszczególnych jąder komórek nowotworowych pod kątem obecności i ilości fosfoproteiny jądrowej Rb. Sekcje wybarwione immunologicznie zostały zinterpretowane za pomocą analizatora obrazu, który wyznaczył gęstość optyczną jąder w stosunku do obszaru jądra (wyrażoną w procentach). Analizowano pięć reprezentatywnych pól każdego nowotworu, a całkowite obszary jądra (wyrażone w mikrometrach kwadratowych) i procent dodatniego barwienia dla Rb w każdym guzie były wyświetlane na histogramie
[więcej w: wiml warszawa, poprzeczne bruzdy na paznokciach, chód spastyczny ]